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水律蛇肺炎细菌性败血症病原的分离鉴定与药敏特性研究

时间:2020-02-23 09:19 来源:互联网 作者:陈元梧 点击:

   导读:水律蛇肺炎细菌性败血症病原的分离鉴定与药敏特性研究,本实验对患肺炎细菌性败血症的水律蛇进行细菌分离鉴定、药敏特性进行研究分析,为养殖过程中防治肺炎细菌性败血症提供科学依据。
水律蛇肺炎细菌性败血症病原的分离鉴定与药敏特性研究
   水律蛇肺炎细菌性败血症,是由肺炎双球菌引起的败血性脓毒血症经过为特征的急性传染病,是蛇类养殖业中常见的一种病症。该病是蛇类常见的呼吸道传染病,多发生于盛夏,常见于产卵后不能尽快恢复体力的雌蛇或经过长期运输的种蛇。具有传播快、治愈慢等特点。引起该病的主要原因通风不良、气温高、温差太大、空气混浊、养殖密度过大等。
   水律蛇养殖经济效益高,近几年养殖的数量在增加,但养殖过程中,很多养殖者管理不善而引发了肺炎细菌性败血症。病初表现为张口呼吸,头与地面呈45度角,口吐白沫,大量饮水,喘息伴有沉闷的“呼啦”声,食欲不振,行动缓慢,不愿归窝,打开口腔可见口腔内有粘痰但不红肿,不久病蛇张口呼吸的频率增多,病蛇时常反转身体,出现共济失调,末期发生痉挛,最后呼吸衰竭死亡。由头部剖开至尾部,可见整条蛇体腔充满淡黄色恶臭液体,暴露在空气中可发生凝固,气管内有大量泡沫样分泌物,病变主要集中在肺部区域,肺脏出血充血,实质发生肝样病变,间质增宽,有些肺部表面附着胶冻样渗出物。肝和胆囊肿胀,其他器官未见肉眼可见病理变化。
   近几年来,水律蛇肺炎细菌性败血症发生越来越普遍,对水律蛇养殖业、养殖者产生了巨大影响。病蛇呼吸困难,食欲不振,常逗留窝外,即使将蛇放人窝内、蛇仍会爬出。体质差或产后未及恢复体质的蛇,比较容易感染此病。如果不及时治疗,可能会在3~5天内危及全群,引起蛇的大批死亡,这是一种传染性极强的疾病,有时,甚至健壮的蛇也难以幸免。通过对患病蛇进行病理解剖,发现肺严重气肿,出血或硬结,萎陷到发生肝变,局部化脓,肺与胸膜粘联,气管有血液粘液和纤维素渗出物,脾肿大1.5倍,有出血性梗塞,肝局部坏死,淋巴结肿大[3]。取肝脏、肠、脾、咽粘液进行细菌分离培养,在培养基上面培养出了患病蛇的致病细菌,通过对分离出的细菌进行形态观察分析以及生化试验进行分析鉴定,最后通过药纸片扩散法对该细菌进行药敏特性分析。
   据报道广东,广西,福建等地很多养殖场都出现了该病,患病蛇治愈率低,死亡率高,传染率高,给养殖业、养殖者造成了巨大的损失。为了科学的防治水律蛇肺炎细菌性败血症,本试验对佛山市南海区松岗镇某一养殖场患病蛇进行了细菌分离鉴定与药敏特性研究,为养殖生产过程中防治此病提供科学理论依据。
   图1.水律蛇外形特征

   1.试验材料与方案

   1.1试验动物
   图2. 病蛇取样
   患病水律蛇4条,体长1.5米,体重1500g,取自于佛山市南海区松岗镇一养殖场。该养殖场养殖水律蛇500条左右,2011年5月初,有部分蛇四处游走,不思归巢,张口呼吸,口吐白沫,食欲不振,养殖户以为是天气炎热所致,后来有陆续有蛇死去。经过解剖发现,病蛇肺部严重气肿,有充血、出血的现象,脾肿大,有出血的现象,肝、肠道等都有充血、出血的现象。
   1.2试验材料
   1.2.1仪器与设备
   解剖剪、手术刀、高压蒸汽灭菌器、电热干燥器、电炉、搪瓷缸、玻璃棒、电子天平、量筒、漏斗、试管、烧杯、锥形瓶、培养皿、接种环、酒精灯、无菌操作工作台、培养箱、冰箱、镊子、葡萄糖,蔗糖,麦芽糖,甘露醇,乳糖五种生化管、0.5麦氏标准比浊管、滴管、显微镜
   1.2.2试验药品
   营养琼脂培养基、1mol/L的NaOH、无水乙醇、无菌生理盐水、无菌药纸片(利福平、庆大霉素、头孢噻吩、痢特灵、氨芐青霉素、菌必治、复方新诺明、先锋霉素、四环素、氟哌酸、链霉素、强力霉素、红霉素、卡那霉素、洁霉素)、蒸馏水、草酸铵结晶紫染色液、碘溶液、碱性复红液
   1.3试验方案
   1.3.1营养琼脂培养基的制备
   (1)称量:用电子天平称33g营养琼脂粉,用量筒准确量取1L蒸馏水。
   (2)溶化:将称量的营养琼脂粉和蒸馏水倒入搪瓷缸中,于电炉上加热溶化,边加热边搅拌,沸腾时立即从电炉上拿下,等泡沫消失后再放在电炉上加热,煮沸2—3次。
   (3)过滤:将煮好的营养琼脂培养基趁热过滤,分装入锥形瓶内。
   (4)灭菌:把装好的培养基整齐地平放入高压灭菌器的内筒中,锥形瓶口盖上棉塞或橡胶塞,直立放入内筒中,在121.3℃灭菌20-30min,把洗好的培养皿一起放进去灭菌。
   (5)分装:将灭菌后的培养基倒入培养皿中,每板约15ml左右,以刚好覆盖平皿底为易。
   (6)无菌检验:把做好的平板培养基放入培养箱中,在37℃的温度下培养24h,若无菌生长则为合格。
   (7)备用:将合格的平板培养基放入冰箱,在0-4℃中保存备用。
   1.3.2试验动物的病理解剖
   (1)表面症状检查:病蛇体长、体重、形态、眼睛、口腔、表皮等。
   (2)内部器官检查:病蛇肝、胆囊、肺、脾、肠、体腔等。
   1.3.3细菌的分离培养
   (1)病料采集:取病蛇肝、肺、脾、肠等病变部位。
   (2)接种:在无菌操作台下,用接种环蘸取病蛇肝、肺、脾、肠等病变部位少许,接种到平板培养基上。
   (3)培养:接种完毕后,把培养皿倒置放入37℃的恒温培养箱中培养24h。
   注:整个操作过程应在无菌操作环境下进行,所用器械及物品均应事先灭菌备用,金属器具包装后高压灭菌或煮沸30min,玻璃器皿可高压灭菌也可干热灭菌,胶皮塞、培养基要高压灭菌
   1.3.4细菌的鉴定
   1.3.4.1菌落形态特征观察
   主要是菌落大小、形状(露滴状、圆形、菜花样、不规则等)、突起或扁平、凹陷、边缘(光滑、波形、锯齿状、卷发状)、颜色(红色、灰白色、黑色、绿色、无色、黄色等)、表面(光滑、粗糙)、透明度(透明、不透明、半透明等)和粘度等。
   1.3.4.2革兰染色法
   (1)制作细菌抹片
   (2)草酸铵结晶紫染色:在已干燥、固定好的抹片上,滴加草酸铵结晶紫染色液,经1-2min,水洗。这时细菌都染成紫色。
   (3)碘溶液助染:加碘溶液于抹片上,作用1-3min,水洗。这时细菌都呈更深的紫色。
   (4)95%酒精脱色:加95%酒精于抹片上,可见标本中一些紫色染料脱出、直到紫色染料不再脱出,水洗。这时有的细菌原染上的紫色已被脱去,呈无色;有的细菌原染上的紫色脱不了,仍然保持紫色。
   (5)复染:加碱性复红液复染10-30s,水洗,这时已脱色的细菌复染成红色,未脱色的细菌呈蓝紫色。
   (6)油镜观察:将染好的片用滤纸盖上吸干,油镜观察,呈蓝紫色的细菌为革兰阳性菌,呈红色的为革兰阴性菌。
   1.3.4.3生化试验(糖发酵试验)
   (1)原理:各种细菌具有的酶不同,有的细菌能分解某些糖类而产酸产气,有的细菌虽然能分解某种糖类,但只产酸不产气,有的细菌则不能分解。酸的产生可以利用指示剂来证明,在配置培养基时可预先假如溴甲酚紫,当细菌发酵糖产酸时,可使培养基由紫色变为黄色。气体的产生可由发酵管顶端有无气泡来证明。
   (2)把培养出的细菌分别接种葡萄糖,蔗糖,麦芽糖,甘露醇,乳糖五种生化管内,另取一支不接种作为对照,将发酵管置于37℃培养。
   1.3.5药敏试验
   (1)原理:含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上,纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后不断向纸片周围扩散,形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌生长被抑制,形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度,并与该药对测试菌的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)呈负相关,即抑菌圈愈大,MIC愈小。
   (2)方法:1、将培养16﹣24h平板上的菌落接种于生理盐水管中,校正浓度至0.5麦氏标准(相当于1.5x108cfu/mL)2、用无菌棉拭子蘸取少量的菌夜,在普通琼脂培养基表面均匀涂抹接种三次,每次旋转平板60℃,最后沿平板内缘涂抹一周。3、将接种的平板置室温下干燥3-5min后用无菌镊子取含药纸片紧贴于琼脂表面,各纸片中心相距应大于24mm,纸片距平板内缘应大于15mm,置37℃培养16-18h后观察结果。

   2.试验结果

   2.1 病理解剖分析
   图3. 患病蛇肺、胆囊、肠道等器官发生病变
   (1)患病水律蛇体长1.5m,体重1500g,病蛇消瘦,腹部触摸有波动感,张口呼吸,盘游不安,不思回洞,目光呆滞,精神不振,失去食欲,口腔常有粘液流出,打开口腔可见口腔内有粘痰但不红肿,大量饮水。
   (2)病蛇内部器官发生病变,肺部严重气肿,有充血、出血的现象;体腔充满淡黄色恶臭液体;肝充血呈暗红色、肿大局部坏死;胃、肠道空,无内容物,肠为紫色,充血;胆汁呈墨绿色;脾肿大,有出血性梗塞,淋巴结肿大。
   2.2 细菌分离培养结果
   图4. 肠道上分离的菌落
   图5.心脏上分离出的菌落
   取患病蛇肺、肠、心脏、咽粘液等组织,在无菌操作台下,用接种环蘸取病蛇肝、肺、脾、肠等病变部位少许,接种到普通营养琼脂培养基上,在37℃培养箱中培养24h,结果肺、肠、肝脏分离出了如(图4)(图5)细菌。
   2.3 细菌的鉴定分析
   (1)菌落的形态特征观察:通过对培养出的菌落进行仔细观察分析,该菌落细小、光滑、突起、圆形、湿润、灰白色。
   图6.革兰染色后在显微镜观察到的图像
   (2)革兰染色:取单个典型菌落,通过革兰染色法,在显微镜下可以清晰的看到如(图6)的结构,结果显示该细菌属于G+双球菌。
   (3)生化试验:把培养出的细菌分别接种葡萄糖,蔗糖,麦芽糖,甘露醇,乳糖五种生化管内,置于37℃下培养,结果如(表1)所示
水律蛇肺炎细菌性败血症病原的分离鉴定与药敏特性研究
   注: ⊕代表产酸产气;+代表只产酸不产气;-代表无反应;
   2.4 药敏试验结果
   对肝脏、肺、肠道上分离出的病原菌进行药敏试验,一共用到氟哌酸、菌必治、卡那霉素、先锋霉素、利福平、庆大霉素、氨芐青霉素、洁霉素、链霉素、强力霉素、复方新诺明、头孢噻吩、红霉素、四环素、痢特灵耐药等十五种药纸片,药敏结果如(表2)所示。
   表2 .肝、肺、肠道分离出菌株对药物的敏感性结果
水律蛇肺炎细菌性败血症病原的分离鉴定与药敏特性研究
   注:抑制圈直径(mm)20以上,极敏;15-20,高敏;10-14,中敏;10以下,低敏;0,不敏
   通过药敏试验发现,庆大霉素、菌必治、氟哌酸、卡那霉素对该病原菌有极敏效果,利福平、痢特灵、复方新诺明、四环素、链霉素、强力霉素、红霉素对该病原菌有高敏效果,头孢噻吩、氨芐青霉素对该病原产生耐药性,洁霉素、先锋霉素已经没有一点效果。

   3.小结

   水律蛇肺炎细菌性败血症已经成为养殖中比较普遍的病害,该病发治愈率低、死亡率高,病蛇初期食欲不振、呼吸不顺畅、张口呼吸、不思归巢,不久后张口呼吸频率增多,病蛇时常反转身体,出现共济失调。末期发生痉挛,最后呼吸衰竭死亡。解剖内部观察,肺严重气肿,出血或硬结,萎陷到发生肝变,局部化脓,肺与胸膜粘联,气管有血液粘液和纤维素渗出物,脾肿大1.5倍,有出血性梗塞,肝局部坏死,淋巴结肿大。2010年8月初广西兴业县洛阳镇某养蛇场发现平日藏匿较好的蛇四处游走,不思归巢,张口呼吸,口吐白沫,养殖户以为是天气炎热所致,于是洒水降温,次日不但未见好转,还出现有蛇陆陆续续死亡;水律蛇肺炎细菌性败血症已经成为水律蛇养殖业危害影响较大的病害之一。
   本实验针对此病进行研究,通过细菌分离鉴定、药敏特性等方法研究发现,水律蛇细菌性败血症主要是由肺炎双球菌引起的败血性脓毒血症,肺炎双球菌是革兰阳性菌,接种葡萄糖,蔗糖,麦芽糖,甘露醇,乳糖五种生化管,结果;葡萄糖,麦芽糖,乳糖产酸不产气,蔗糖,甘露醇不产酸不产气。此病危害大,管理防治不善,会传染给处在同一个环境下的其他养殖动物,进而造成巨大的损失。通过药敏试验发现,庆大霉素、菌必治、氟哌酸、卡那霉素对该病原菌有极敏效果,利福平、痢特灵、复方新诺明、四环素、链霉素、强力霉素、红霉素对该病原菌有高敏效果,头孢噻吩、氨芐青霉素对该病原产生耐药性,洁霉素、先锋霉素已经没有一点效果。通过此试验,为养殖者防治水律蛇肺炎细菌性败血症提供科学依据。养殖者可根据自身养殖环境,选择治疗效果最优越的方案。
通风不良,空气不流畅,湿度大,温度高,温差大,养殖密度大是引发此病的主要诱因,多发生于盛夏,常见于产卵后不能尽快恢复体力的雌蛇,经过长途运输的种蛇等。因此在养殖过程中要注意蛇舍保持通风流畅,空气清新,温度高时,要做好防暑工作,避免白天与夜晚温差过大,养殖密度要合理投放,养殖环境要保持清洁。针对容易患病的蛇,在饲养过程中,科学的投喂一些提高免疫力的药物。发病蛇要及时治疗,以免造成严重经济损失。

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